Продажа и сервис
                  тел.
044 - 233 09 19
        моб. тел. 050 - 213 09 19
                             063 - 233 09 19
е-mail:
info@haemostasis.com.ua
   вопросы по исследованию      
   системы гемостаза
горячая линия (044)233-09-19
Комплексное оснащение лабораторий гемостаза,
 профессиональный подбор аппаратуры и реагентов.
Протромбиновый тест: протромбиновое время (ПВ), протромбиновый индекс (ПИ), МНО, протромбин по Квику
оценивает процесс превращения протромбина в тромбин. ПТ  показатель свертывания плазмы при добавлении к ней
избытка тромбопластина и оптимального количества кальция.
Определение ПТ является одним из наиболее часто выполняемых анализов в коагулогии. ПТ имитирует внешний путь свертывания крови, когда из тканей при повреждении выделяется так называемый тканевой фактор (ТФ), липопротеин, которыйв обычных условиях связан с клеточной мембраной. При попадании в кровоток ТФ связывается (образует комплекс) с постоянно циркулирующим в крови фактором VII. Этот комплекс активирует
 фактор X, который вместе с фактором V, фосфолипидами в присутствие ионов кальция превращает неактивный протромбин плазмы крови
(фактор II) в активный фермент тромбин, образующий фибриновый сгусток из растворимого плазменного белка фибриногена (фактор I).
Таким образом, ПТ отражает нарушение активности трех витамин-К-зависимых факторов (II,VII,Х), фибриногена (фактор I) и фактора V и
используется для скринингового исследования свертывающей системы, мониторинга терапии тромбозов пероральными антикоагулянтами,
диагностики заболеваний печени, выявления дефицита витамина К, диагностики диссеминированного внутрисосудистого свертывания.
Для профилактики и длительного лечения больных с риском тромбоэмболических заболеваний сегодня наиболее часто используют оральные антикоагулянты (ОА). По данным Baglin, в 1998 году варфарин принимал каждый 200-й житель Великобритании.
Основным методом лабораторного контроля терапии ОА остается предложенный А. Квиком в 1935 году протромбиновый тест (ПТ). Его суть заключается в свертывании цитратной плазмы в присутствии тромбопластина и оптимальной концентрации ионов Са+
2. Популярность теста связана с тем, что он отражает снижение большинства витамин К-зависимых прокоагулянтов (факторов II, X, VII), прост в исполнении, легко поддается автоматизации и относительно дешевый. Однако различная чувствительность препаратов тромбопластина к вызванным ОА изменениям уровня факторов свертывания обусловливала значительные сложности в оценке результатов ПТ в различных лабораториях.
В роли тканевого фактора, запускающего каскад свертывания, используют частично очищенные экстракты тканей мозга человека, кролика,
быка, экстракты легких или плаценты человека, получившие название 
тромбопластинов. Кальций плазмы, связанный цитратом натрия,
заменяют на вносимый экзогенно стандартный раствор 0,025М хлористого кальция и проводят реакцию при постоянной температуре  37°С.
Техника выполнения ПТ очень простая. Достаточно иметь термостат на 37°С, секундомер, пробирки и пипетки, а наличие простейшего коагулометра значительно уменьшает напряженность работы лаборанта и повышает точность и производительность анализа. Однако, при очевидной простоте выполнения самого теста, оценка его результатов представляет собой серьезную проблему, которая окончательно не решена до настоящего времени.
 Две основных причины обуславливают сложность проблемы. Во-первых, в протромбиновом тесте реализуется ряд последовательных и взаимовлияющих реакций, и суммарная скорость зависит от множества параметров. Во-вторых, время свертывания нормальной и, что исключительно важно, патологической плазмы значительно варьирует в зависимости от источника и метода получения тромбопластина, а соответственно, и его свойств  чувствительности и активности.
Важно определить такие понятия, как
активность и чувствительность тромбопластина. Активность характеризуется временем свертывания нормальной плазмы данным препаратом (11-23 сек). Чувствительность тромбопластина  это способность реагировать на снижение уровня факторов протромбинового комплекса, т.е. давать более значительное увеличение протромбинового времени. Иначе говоря, при дефиците факторов свертывания (независимо от причины) мы ожидаем гипокоагуляцию  удлинение протромбинового времени. Таким образом, тромбопластины могут обладать «высокой активностью» (11 сек), но плохо «чувствовать» снижение концентрации факторов, или «низкой активностью»  (23 сек), при высокой чувствительности, к дефициту факторов.
Международный комитет по стандартизации в гематологии выдвинул ряд требований, которым должны отвечать тромбопластины. Это  чувствительность к дефициту факторов протромбинового комплекса, причем, не только к нормальным, но и к белкам, образовавшимся в результате антикоагулянтной блокады витамина К. Также тромбопластин необходимо проверять на чувствительность к фактору VII. Реагент не должен содержать гемоглобин и вирусы гепатита и ВИЧ, должен быть прозрачным, сохранять активность при хранении.
В настоящее время выпускаются несколько типов тромбопластинов. Нерастворимые в воде, так называемые
кадаверные тромбопластины, использовавшиеся ранее в протромбиновом тесте - повсеместно должны быть заменены на лиофильно высушенные и полностью растворимые в воде реагенты, или же жидкие готовые к использованию реагенты.
Нерастворимые в воде тромбопластины (т.н. кадаверные) нестандартны по активности, т.к. требуют проведения подготовительных мероприятий: взвешивания, растирания в ступке, центрифугирования для отделения активной надосадочной жидкости, и активность целевого продукта в этом случае зависит от методики его приготовления и квалификации лаборанта. Кадаверные тромбопластины могут применятся только для получения фибринового сгустка к примеру в методике определения количества фибриногена по Р.А.Рутберг.
Водорастворимые (лиофильно высушенные тромбопластины), более стандартны по активности, так как для приготовления рабочего раствора требуется лишь внести во флакон с лиофильно высушенным реагентом стандартное количество дистиллированной воды. Жидкие тромбопластины готовы к применению и еще меньше подвержены ошибочным действиям со стороны оператора.
Для выражения результатов ПТ в разное время использовалось:
·    Время свертывания в секундах;
·    Протромбиновое отношение (ПО), которое определяется как время свертывания плазмы больного/время свертывания нормальной плазмы;
·    Протромбиновый индекс, выраженный в % (ПИ), который определяется как время свертывания нормальной плазмы/время свертывания
плазмы больного
х 100%.
·    Международное нормализованное отношение (МНО);
·    протромбин по Квику.
Первый способ выражения результата ПТ  время свертывания, наименее информативен и от него следует отказаться. На время свертывания влияют концентрация и активность факторов плазмы пациента, а также активность и чувствительность используемого тромбопластина.
Второй и третий способы выражения результатов анализа  ПО и ПИ, в большей степени свободны от влияния вариаций активности различных видов тромбопластинов. Однако выражение ПТ в виде ПО или ПИ не дает возможности дифференцировать дефицит факторов свертывания от снижения их активности в результате действия антикоагулянтов. Более того, изменение времени свертывания и, соответственно, ПО и ПИ будет более значительным для высокочувствительного тромбопластина и менее значительным при применении низкочувствительного тромбопластина.
 Проблема усложняется тем, что значения этих параметров варьируют не только между лабораториями, но и в пределах одной лаборатории при переходе от одной партии тромбопластина к другой, даже если они выпущены одним и тем же производителем.
В 1981г. ВОЗ был принят метод стандартизации ПТ, в 1983г его модифицировали. В основе метода лежит установленное исследованиями по программам Международного комитета по Стандартизации в Гематологии и Международного Комитета по Тромбозу и Гемостазу наличие линейной зависимости между логарифмами протромбинового времени (lgПВ), определенными с использованием разных тромбопластинов.
lgПВэ - полученный с использованием эталонного тромбопластина ВОЗ или Международный индекс чувствительности (МИЧ принят за 1,0); lgПВтр  полученный с использованием различных неаттестованных тромбопластинов.
Если по оси ординат отложить логарифмы величин протромбинового времени для плазмы донора и для 6-7 плазм больных со сниженным (в результате лечения антикоагулянтами) временем, определенные с использованием Международного эталона тромбопластина, а по оси абсцисс логарифмы величин ПВ исследуемого тромбопластина, то по тангенсу угла наклона графика определяют Международный индекс чувствительности - МИЧ (ISI - английская аббревиатура от International Sensitivity Index). В 1982 г. был учрежден Международный эталонный препарат кроличьего тромбопластина (кодовый номер КВТ/79) с МИЧ 1,4. В настоящее время в связи с распространением ВИЧ и вирусов гепатита использование тромбопластинов из кадаверного мозга запрещено и разработаны рекомбинантный эталон тромбопластина (гТР/95) и кроличий КВТ/90, оба реагента с МИЧ 1,0.
Чувствительность тромбопластина различных фирм-производителей должна вычисляться по отношению к этому стандарту тромбопластина ВОЗ. При этом вычисляется МНО  Международное нормализованное отношение, английская аббревиатура от International Normalized Ratio (INR). При возведении значения ПО, определенного с любым тромбопластином, в степень МИЧ (или умножая на МИЧ, если используются логарифмические координаты).
lg (ПВтр/ПВэ)
мич = МИЧ lg (ПВтр/ПВэ)= ПО. Полуученное в результате этих вычислений ПО будет иметь то же значение что и ПО, которое было бы получено для данной плазмы с использованием Международного эталонного тромбопластина. Именно эта математическая операция  возведения ПО в степень, характеризующую чувствительность используемого препарата тромбопластина позволяет перевести результаты теста ПВ в один масштаб.
Введение МНО позволяет сравнивать результаты измерений с различными тромбопластинами и использовать установленные в международных центрах стандартизации терапевтические границы необходимой и достаточной антикоагулянтной терапии. МИЧ более чувствительных реагентов близок к 1,0. МИЧ менее чувствительных составляет 2,0-2,8. Т.е, чем выше значение МИЧ, тем менее чувствителен тромбопластин к изменению содержания компонентов протромбинового комплекса и, следовательно, тем больше может быть ошибка результата ПТ.
 Нужно иметь в виду, что при возведении результата измерения протромбинового времени в степень МИЧ мы также возводим в определенную степень и погрешность измерения. Соответственно, чем больше МИЧ, тем в большее число раз мы увеличиваем ошибку результата измерения.
 Применение нечувствительных тромбопластинов в клинике нежелательно, т.к. они не улавливают снижения активности фактора VII, который первый реагирует на введение пероральных антикоагулянтов и поэтому является основным маркером антикоагулянтной терапии. Если же ПТ не меняется, хотя активность фактора VII снижена, клиницисты получают неправильное представление о результатах проводимой терапии, продолжают введение антикоагулянта, а это может вызвать кровотечение у пациентов.
Введение системы МНО ознаменовало собой значительный прогресс в стандартизации теста ПТ. Основная цель, которую преследовало введение МНО, состояла в обеспечении оптимизации терапии оральными антикоагулянтами. Использование единой системы контроля позволяет обобщать опыт, накопленный в разных клиниках, для подбора оптимального соотношения между риском развития тромбоза и кровотечения. Исследования, выполненные в последние годы, показали, что менее интенсивная антикоагуляция, обеспечивает эффективную профилактику тромбозов при меньшем риске кровотечений. В специальном докладе Американской Кардиологической Ассоциации, опубликованном в 1994 году, предложено при подборе дозы антикоагулянтов ориентироваться на терапевтические пределы МНО от 2,0 до 3,5.
 Таким образом, определение ПТ в единицах МНО правомочно только при лечении пероральными антикоагулянтами и недопустимо использовать у трех групп больных: при скрининговом исследовании свертывающей системы, у пациентов с нарушением функции печени, и у пациентов, только начавших курс лечения пероральными антикоагулянтами.
 Схема определения МНО, при использовании тромбопластина, стандартизованного по МИЧ:
  Определить ПВ свежего пула донорской плазмы или время свертывания контрольной нормальной плазмы ПВнп
Рассчитать ПО плазмы пациента
ПО = ПВпац/ПВнп, где:
ПВпац - протромбиновое время пациента в сек;
ПВнп  протромбиновое время пула донорской (или контрольной нормальной)  плазмы в сек;
Рассчитать МНО для плазмы пациента, МИЧ указан в паспорте набора.
МНО= ПО
МИЧ
ПРИМЕР:
1.    Экспериментально получены следующие данные:
Время свертывания контрольной плазмы или ПВнп= 16,0 сек.
Время свертывания плазмы пациента или ПВпац = 22,0 сек.
2.    В паспорте к тромбопластину указано значение МИЧ = 1,12.
3.    Производим расчет ПО для плазмы пациента: ПО = 22,0 / 16,0 = 1,38
4.    Производим расчет МНО для плазмы пациента: МНО= 1,38
1,12 = 1,43
 
 Определение протромбина по Квику
Это метод определения активности в процентах факторов протромбинового комплекса у данного больного, рассчитанная (в %) по калибровочному графику зависимости продолжительности ПВ от активности факторов протромбинового комплекса. Калибровочный график строят путем разведения нормальной плазмы с аттестованной активностью факторов протромбинового комплекса и измерения времени свертывания каждого разведения. Если содержание этих факторов в нормальной плазме принять за 100%, то в разведенной в два раза оно будет 50%, в четыре  25%, и т.д. Таким образом, исследователь моделирует явление дефицита факторов протромбинового комплекса. Следовательно, ПТ по Квику на этой, искусственно созданной, модели позволяет оценить имеется ли у пациента снижение уровня факторов свертывания и на сколько процентов. Графики зависимости времени свертывания от концентрации факторов протромбинового комплекса имеют форму обратной функции (у=1/х). Использование нелинейных графиков для перевода секунд в проценты протромбина не очень удобно. Поэтому для вычислений применяется линеализация графика в координатах 1/% протромбина (т.е. 100%  0,01; 50%  0,02; 25%  0,04; 12,5%  0,08) от времени свертывания.
Недостатком этого метода калибровки является то, что разведение плазмы моделирует только снижение концентрации факторов, которое может наблюдаться, например, при нарушении синтеза белков в печени. Однако, при других патологиях (дефицит витамина К, или прием его антагонистов   оральных антикоагулянтов) концентрация факторов может быть близкой к норме, но их функциональные свойства, определяющие взаимодействие и активацию факторов, существенно нарушены.
В завершении анализа ПТ остановимся на одной методической проблеме. Этот тест может выполняться с использованием как плазмы, полученной из венозной крови, так и капиллярной крови. Определение в капиллярной крови представляется привлекательным, т.к. не требует пункции вены. Однако, при кажущейся простоте, в действительности оно сопряжено с рядом проблем. Первая и главная заключается в большой вероятности активации свертывания при сборе капиллярной крови. Кровь, проходя через поврежденную ткань, неизбежно контактирует с тромбогенной поверхностью и может активироваться. Это приводит вначале к «кажущемуся» увеличению содержания факторов (гиперкоагуляции), которое в действительности может быть лишь следствием их активации, а затем переходит в снижение содержания факторов (гипокоагуляцию), обусловленную низкой стабильностью активированных форм. Поэтому при исследовании системы гемостаза рекомендуется использовать образцы венозной крови.
Использование капиллярной крови для определения МНО возможно на специально разработанных для этого приборах.
  Интерпретация результатов протромбинового теста. Повышение активности факторов протромбинового комплекса (активация всех компонентов «внешнего» механизма свертывания крови) наблюдается при:
·    полицитемии,
·    тромбоэмболических состояниях,
·    злокачественных новообразованиях.
Снижение активности факторов протромбинового комплекса обнаруживается при:
·    гепатитах,
·    циррозе печени,
·    холангите,
·    лучевой болезни,
·    хроническом панкреатите,
·    врожденной гипопротромбинемии,
·    использовании лекарственных средств (гепарина, дикумарина, неодикумарина, фенилина).
Значительное удлинение протромбинового времени наблюдается в поздних стадиях ДВС-синдрома, при гипергепаринемии, характеризующейся геморрагическим диатезом. Удлинение времени образования сгустка происходит вследствие недостатка одного из факторов протромбинового комплекса (V, VII, X), а также фибриногена.