вопросы по исследованию
         системы гемостаза
горячая линия
(044) 233-09-19
         Продажа и сервис
                  тел.
044 - 233 09 19
        моб. тел. 050 - 213 09 19
                             063 - 233 09 19
е-mail:
info@haemostasis.com.ua
Комплексное оснащение лабораторий гемостаза,
 профессиональный подбор аппаратуры и реагентов.
    Инструкция к набору "АЧТВ с элаговой кислотой высокой чувствительности к ВА".
APTT- ES. Cat. No. 5397 H, 5397, 5398
Кат ном 5397Н (5 х 5 мл АЧТВ-ES-реактив +5 х 5 мл кальция хлорид
Кат ном 5397(5 х 10 мл АЧТВ-ES-реактив +5 х 10 мл кальция хлорид)
Кат ном 5398(10 х 10 мл АЧТВ-ES-реактив +5 х10 мл кальция хлорид)
I. Применение
Этот набор предназначен для выполнения АЧТВ-теста и обладает высокой чувствительностью к волчаночным антикоагулянтам. Активаторами
свертывания здесь представлены: высушенный экстракт мозга кролика и эллаговая кислота. Измерения этим набором могут производиться
вручную, на полуавтоматическом и автоматическом анализаторе. АЧТВ отражает нарушения внутреннего пути свертывания (факторы VIII, IX,
XI, XII,  прекалликреин и высокомолекулярный кининоген). Также АЧТВ тест используется для количественного определения этих факторов и
для контроля гепаринотерапии.
Волчаночные антитела (ВА) и неспицифические антитела (Волчаночно-подобные антитела) вызывают увеличение времени АЧТВ. Однако, при
низкой концентрации ВА
выраженного изменения АЧТВ может не произойти. Чаще всего в качестве реактива используют один из трех активаторов: каолин, кремний,
эллаговая кислота. Эллаговая кислота превосходит остальные активаторы за счет большей растворимости. Время инкубации при этом
активаторе уменьшается с 5 минут до 3.
АЧТВ - тест является клотинговым (измеряется время образования фибринового сгустка). В этом тесте цитратная плазма инкубируется 3 минуты
при 37°C вместе с АЧТВ-реактивом, а затем добавляется предварительно прогретый до 37°C кальция хлорид. С этого момента начинается отсчет
времени реакции. Время (в секундах) с момента добавления  кальция хлорида и до образования сгустка является результатом (в секундах) АЧТВ
теста. Момент образования сгустка детектируется различными способами.
II. Меры предосторожности
Реактивы из этого набора предназначены только для
in vitro диагностики. Не принимать внутрь!
Надевайте перчатки при работе с любым компонентом набора. Обращайте внимание на предупреждающие значки на флаконах и на упаковке.
III. Реактивы
1.    АЧТВ-ES реактив.
Содержит 0.1 mM эллаговой кислоты с суспензией фосфолипидов, полученных из высушенного мозга кролика. Также в состав входят буфер,
стабилизаторы, консерванты (включая 0.2% фенол).
Приготовление. Реагент уже готов к использованию. Осторожно переверните флакон несколько раз, чтобы получить однородную суспензию.
2.    Кальция хлорид реактив 0.025 M.
Приготовление.
Реагент уже готов к использованию.
3.    Другие компоненты набора.
В каждый набор вложена инструкция по использованию.
IV. Хранение и стабильность
1.    АЧТВ-ES реактив (жидкий)
Реактив должен храниться при 2ч6°C. Избегайте загрязнения реагента.
Не замораживать!
В норме реактив представляет собой бледно зеленый гомогенный раствор. Допускается наличие зеленоватого осадка, который должен
мгновенно исчезать при помешивании. В случае изменений другого рода (сопровождаемых  «непрохождением» контролей), скорее всего,
произошло загрязнение.
2.    Кальция хлорид 0.025 M (жидкий)
При хранении при 2ч6°C реактив имеет срок годности, указанный на этикетке. Помутнение раствора говорит о его загрязнении.
V. Необходимое, но не поставляемое оснащение
1.    Анализатор (коагулометр)
2.    Таймер.
3.    Парафильм.
4.    Точная пипетка на 100 или 50 мкл.
5.    Контроли норма + патология.
Также для определения факторов внутреннего пути свертывания:
6.    кат ном 5185 SARP.
7.    кат ном 5375/5488 Вероналовый буфер.
8.    кат ном 5193/5793 плазма, дефицитная по фVIII.
9.    кат ном 5194/5794 плазма, дефицитная по фIX.
10.    кат ном 5196/5796 плазма, дефицитная по фXI.
11.    кат ном 5197/5797 плазма, дефицитная по фXII.
VI. Сбор и приготовление образцов
Кровь собирается в вакутейнеры. Соотношение объемов крови и натрия цитрата должно быть 9:1. Натрия цитрат может быть 3.2% или 3.8%. Отцентрифугируйте при 2000-3000g в течение 15 минут. Плазма должна храниться при температуре 2ч6°C. Тесты должны проводиться в течение 2 часов с момента сбора или плазму можно хранить при -20°C в течение 2 недель или месяц при -70°C. Быстро разморозить при 37°C. Не хранить при 37°C более чем 5 минут, иначе могут инактивироваться Волчаночные антитела.
Ложные результаты могут быть получены из-за загрязнения пробы тканевыми жидкостями. Старайтесь не трясти пробу, избегайте пузырьков и пены. Учитывайте влияние лекарственных препаратов. При разрушении тромбоцитов выделяются вещества, которые могут ингибировать Волчаночные антитела.
VII. Пошаговое руководство(Анализаторы Helena, Rayto работают с минимальным объемом реагентов 75 мкл. Если у вашего анализатора
другой рабочий объем кюветы, то необходимо пропорционально увеличить количество реагентов и образца).
Все пипетки, пробирки, шприцы должны быть пластиковыми.
Выполнение анализа
1.    Соберите кровь для анализа в соответствии с этой инструкцией.
2.    Приготовьте контрольные плазмы в соответствии с вложенными инструкциями.
3.    Помешайте и прогрейте АЧТВ-реактив и кальция хлорид до 37°C.
4.    Поместите 100 мкл плазмы пациента (контроля) в реакционную пробирку.
5.    Осторожно переверните флакон с АЧТВ-реагентом, чтобы растворить возможный осадок.
6.    Добавьте в реакционную пробирку 100 мкл АЧТВ-реагента (там уже есть плазма).
7.    Инкубируйте смесь при 37°C ровно 3 минуты.
8.    Добавьте 100 мкл прогретого кальция хлорида.
9.    Таймер остановится автоматически при образовании сгустка.
10.    Делайте все тесты в дубле. Если коэффициент вариации превышает установленную Вами норму (обычно менее 5%)- то переделайте тест.
VIII. Интерпретация результатов
Тест должен проводиться с точностью до 1/10 секунды. Рекомендуется установить референсные значения для Вашей лаборатории (среднее
арифметическое ± 2 среднеквадратичных отклонения). Результаты могут быть завышенными, но не заниженными. В случае заниженных
результатов, нужно произвести измерения заново.
Заниженные результаты связанны с тромбозом
in vivo (тромбоз вен, ДВС-синдром).
IX. Контроль качества
Каждой лаборатории необходимо устанавить программу контроля качества. Перед проведением тестов должны быть измерены нормальная и
патологическая плазма, чтобы убедиться, что реактивы не испортились и прибор исправен. Если измерения контролей не проводились, то все
полученные результаты признаются недостоверными.
Компания Хелена предлагает следующие виды контролей для этого теста:
1.    кат ном 5186 Norm-Trol 1
2.    кат ном 5187 Аb-Trol 2
3.    кат ном 5183 Аb-Trol 3
4.    кат ном 5301 SAC-1
5.    кат ном 5302 SAC-2
X. Референсные значения
Компания Хелена произвела измерения этим набором 28 замороженных плазм от здоровых взрослых доноров. Сбор крови проводился в
вакутейнеры (3.8%натрия цитрата), измерения проводились на приборе Cascade 480.
Результат составил: 21.9ч31.7 секунд (±2 SD). Среднее арифметическое = 26.8 секунд.
Эти значения приведены как пример. Они могут различаться между лабораториями из-за разницы в приборах и методиках. Рекомендуется
самостоятельно установить референсные значения.
XI. Мониторинг гепаринотерапии
При контроле гепаринотерапии важно учитывать разную восприимчивость людей к гепарину. Терапевтическая доза гепарина лежит в области
0.2ч05 единиц/мл.
Следует помнить:
1.    Время сбора крови очень важно, так как период полураспада (период полуэлиминации) гепарина в организме человека равен 1.5 часа.
2.    При аггрегации тромбоцитов, а также при их разрушении, выделяется IV-тромбоцитарный фактор, который нейтрализует гепарин. Чтобы
этого избежать, следует правильно забирать кровь и готовить пробу.
3.    Следует провести АЧТВ-тест пациенту до начала терапии, причем в той лаборатории, в которой и будет осуществлятся мониторинг.
4.    Разные приборы (с разными методами детекции сгустка: механический, оптический) имеют разную чувствительность к гепарину. Поэтому,
мониторинг нужно проводить на одном приборе.
5.    Калибровка гепарина должна проводиться при изменении номера серии реагента, а также через определенные интервалы при одной и той
же серии. Также нужно использовать один и тот же гепарин (он может быть из слизистых оболочек свиньи или из бычьих легких).  
XII. Ограничения
Если пациенту сделают АЧТВ-тест в разных лабораториях, то результаты могут отличаться. Метод детекции, температура, рН, способ забора крови, тип антикоагулянта, время хранение проб,- все это очень важные моменты при проведении теста. Методика сбора крови и ее хранения должны быть стандартизированы и должны контролироваться. Неожиданные результаты должны быть проверены другими методиками. Разрушение тромбоцитов приводит к выделению фосфолипидов, которые могут нейтрализовать ВА. Использование малых объемов проб не рекомендуется, так как они хуже держат рН. На этот тест влияют различные лекарства. Увеличение АЧТВ наблюдается при приеме дифенина (дифенилгидантоин), гепарина, варфарина и препаратов, применяемых для рентгена. Уменьшение АЧТВ наблюдается при приеме пероральных контрацептивов (особенно эстрогенов). Таким образом, лабораториям рекомендуется самостоятельно устанавливать референсные значения для пациентов и для контролей.
XIII. Аналитические характеристики
Компания Хелена приводит данные характеристики только для примера. Вы должны сами их определить.
Точность.
Внутри одной аналитической серии.
Контроль
 Время, сек.
 Среднеквад.откл.
 Коэф. вариации.
 Кол-во проб, шт
 Norm Trol 1
 29.7
 0.24
 0.8%
 20
 Ab-Trol 2
 52.4
 0.64
 1.2%
 20
 Ab-Trol 3
 77.4
 1.01
 1.3%
 20
 
 Между аналитическими сериями.
Контроль
 Время, сек.
 Среднекв. откл.
 Коэфф.вариации
 Кол-во проб, шт
 Norm Trol1
 30.1
 0.44
 1.5%
 60
 Ab Trol2
 52.5
 1.91
 3.6%
 60
Сравнение с АЧТВ-набором от другого производителя.
Компания Helena произвела сравнение АЧТВ-набора Helena c АЧТВ-набором другой фирмы. При этом использовались пробы от здоровых
доноров и от доноров с различными заболеваниями (волчаночные антитела, недостаток факторов, их комбинация и гепаринотерапия). Всего
было протестировано 103 пробы (измерения проводились в дубле).
Получены следующие характеристики:
Y=1.085-4.77    Y=APTT-ES. Corr. Coeff.(r)=0.975  X=набор от другой фирмы, принятый за референс.
Линейность при калибровке наборов для определения недостаточности факторов.
Коэффициент линейности (r2) при калибровке факторов VIII, IX, XI, XII был равен 0.99 и выше.
XIV. Литература
1.    Basu, D. et al., A Prospective Study of the Value of Monitoring Heparin Treatment With the Activated Partial Thromboplastin Time, N Eng J Med 287:
324-327, 1972.
2.    Brandt, J.T. and Triplett, D.A., Laboratory Monitoring of Heparin. Effect of Reagents and
    Instruments on the Activated Partial Thromboplastin Time, AJCP 76: 530-537, 1981.
3.    Proctor, R.R. and Rapaport, S.I., The Partial Thromboplastin Time Test with Kaolin, AJCP 36: 212-219, 1961.
4.    Langdell, R.D. et al., Effect of Antihemophilic Factor on One-Stage Clotting Tests, J Lab Clin Med 41: 637-647, 1953.
5.    Triplett, D.A., ED., Standardization of Coagulation Assays: An Overview, College of Am Path, Skokie, Ill, pg 4, 1982.
6.    Young, D.S. et al., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 3rd ed., AACC Press, Washington, D.C., 1990.
7.    Kelton, J.G. and Hirsh, J., Bleeding Associated with Antithrombotic Therapy, Semin Hematol 17:    259-291, 1980.
8.    Estes, J. and Poulin, P., Pharmacokinetics of Heparin, Thromb Diath Haemorr 33: 26-35, 1974.
9.    Solomon, G., Hilgartner, M., Kutt, H., Neurology 22:1165, 1972.
10.    Adams, R., Harrison, J., Scott, P., Quarterly J. of Med. 38:425, 1969.
11.    Ambrus, J., Schimert, G., Lajos, T., Ambrus, C., Mink, I., Lassman, H., Moore, R., Melzer, J.J., Med.2:65, 1971.
12.    Crowell, E., Clatanoff, D., Kiekhofer, W.J., Lab. Clin. Med. 77:551, 1971.
13.    NCCLS, Collection, Transport and Processing of Blood Specimens for Coagulation Testing and
    Performance of Coagulation Assays, 2nd ed. H21-A2, 1991.
14.    NCCLS, How to Define, Determine, and Utilize Reference Intervals in the Clinical Laboratory
    Proposed Guideline - C28P, 1992.